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波尔山羊胚胎移植研究进展

发布时间:2013-05-14 10:42 新闻来源:未知 作者:admin
      自1995年我国开始引进波尔山羊(Boer goat)以来,因其体格大、生长快,屠宰率高,改良本地山羊杂交优势明显而倍受广大养羊户的青睐,价格居高不下,种羊供不应求,从而为波尔山羊的胚胎移植(embryo transfer,ET)提供了广阔的市场和巨大的空间。为缓解波尔山羊的供需予盾,加快波尔山羊改良本地山羊的步伐,国内多数省、区开始利用ET技术迅速扩繁波尔山羊。据1999-2001年召开的三次全国养羊生产交流会不完全统计,波尔山羊超排头均可用胚胎多数在10枚以上;鲜胚移植妊娠率50-70%。截至2001年,全国存栏波尔山羊6000只以上,除进口约3000只外,其余2000均是应用ET技术扩繁增加的。ET技术不仅在提高波尔山羊供种能力方面发挥了巨大作用,而且也取得了显著的经济效益和社会效益。本文就近年来的研究资料将波尔山羊ET技术的研究进展介绍如下: 
  1、供、受体羊选择 
  1.1 供体羊选择 
  进行ET的供体母羊应具有优良的遗传特性和较高的育种价值,是健康无病的,生殖系统机能正常,无难产史和屡配不孕史,膘情适中。供体母羊应符合品种标准,具有较高的生产性能和遗传育种价值;年龄2.5-6岁为宜,青年羊至少1.5岁(18月龄)以上,经产羊应无空怀史。应选择生产性能高,经济价值高,育种价值高的母羊作为供体。供体必须具有良好的繁殖能力,繁殖史好,易配易孕,分娩顺利,无难产或胎衣不下现象;生殖器官正常,性周期正常,发情表现明显,营养良好,体质健壮,健康无病[3]。在国内波尔山羊供体母羊的选择中,均以1.5岁以上的经产母羊为主(见表),其中张立等(2002)选择体质健壮,有正常发情周期,无遗传和传染性疾病,年龄在10-15月龄的育成波尔山羊母羊作为供体,结果25只羊有19只冲出可用胚胎达到 10枚(含10枚)以上[4]。笔者(2002)选择8-12月龄的育成母羊进行超排处理,平均冲胚9.18枚,但明显低于成年母羊 (15.38枚)[5]。 
供体母羊选择情况统计表 
  1.2 受体羊选择 
  受体羊可选用优良品种的土种山羊,但也应具有良好的繁殖性能和健康的体况,体型要求中、大型。在拥有大量受体的情况下,可选择自然发情与供体发情时间相同或相近的母羊,或者发情时间误差不超过24h[3]。受体羊应体型较大,有良好的繁殖性能,无生殖器官疾患。子宫和卵巢幼稚病、卵巢囊肿等不能作为受体。要有良好的健康状态,检疫和疫苗接种与供体羊相同[1]。王建民(2000)提出受体羊应为正常的经产羊[2]。笔者(2002)在受体选择时的标准为:年龄1-4岁,体重30-60kg,胎次1-5胎,空怀、膘情中等以上,无流产史、空怀史、乳房发育良好,乳头明显、无肿块[5]。 
  2、超数排卵 
  2.1 超数排卵的作用及原理 
哺乳动物卵巢中含有大量的卵泡,约为200000-400000个,但在有限的生命过程中经自然发情排出的卵子数量有限,大部分在发育的不同阶段闭锁退化[6]。超数排卵(Multiovulation,MO)的原理是利用动物发情周期的一个阶段,通过外源激素处理,提高血液中促性腺激素浓度,降低发育卵泡的闭锁率,增加早期卵泡发育到高级阶段(成熟)卵的数量。MO是极为复杂的一系列过程累积产生的结果,至今对它的实质还未完全清楚[3]。可靠的胚胎来源是ET的首要条件,只有MO运用到ET中,才能大大提高ET的效率,所以MO是ET最为关键的措施和环节。 
  2.2 MO方案和结果 
  2.2.1 方案一:FSH-P采用3d注射法,把母羊发情之日作为0d,从母羊发情的第15d开始,早晚间隔12h各注射1次FSH-P,连续3d,递减注射最后1d同时注射ICI80996,每d2次,0.08mg/次,结果春季3只供体冲胚16枚,其中可用胚15枚;秋季5只供体冲胚125枚,其中可用胚123枚[7]。 
  2.2.2 方案二:采用阴道栓+340mgFSH3d6次股二头肌注射,最后一次注射时撤栓,结果22只供体,冲胚318枚,其中有效胚为314枚[8]。 
  2.2.3 方案三:FSH递减法,在波尔山羊自然发情或经同期化处理发情后第10-12d肌注FSH,连续3d,每 d2次,每d间隔8-12h,在第6针同时注射PGF0.1mg/只,之后24h注射LH-RH25mg/只,结果16只供体冲胚329枚[9]。 
  2.2.4 方案四:①自然发情日为0d,第15-18d肌注Fsh,连续3d,每早晚2次递减注射,发情时注射LH,结果26只供体平均采集胚胎22.86枚,其中可用胚16.88。②ICI间隔11d进行2次诱导发情,发情后按①进行MO,结果13只供体平均冲胚20.30枚,其中可用胚17.30枚。③选任意1d结供体母羊阴道内放置CIDR,第15-17d开始按①进行MO,结果5只供体平均冲胚21枚,其中可用胚11枚[10]。 
  2.2.5 方案五:0dPG,12dFSH,13dFSH,14dFSH+PG,15天LRH,FSH为递减法,总剂量为150-250 u,8只供体平均采胚13.8枚[11]。 
  2.2.6 方案六:供体羊放入由孕激素甲基炔诺酮30-45mg制成的海绵栓,当天为0d。在第14d上午一次肌注PMSG500IU,第16d取出阴道栓,结果23只供体共获可用胚胎406枚[12]。 
  2.2.7 方案七:供体羊的周期发情采用2次PG,发情的第15d开始超排,连续3d,注PG后24h开始观察发情,发情后立即配种,同时注射LH,结果31只供体冲胚422枚,其中可用胚269枚[4]。 
  2.2.8 方案八:子宫颈口埋入PRID第10d,连续3d肌过FSH,每d2次,最后1d下午注射FSH的同时注射PGF20.15mg/只,次日下午肌注LH-RH50IU/只,结果9只供体冲胚89枚[13]。 
  2.3 影响因素 
  2.3.1 激素剂量对MO效果的影响。张令进等(2000)的试验表时,波尔山羊对FSH的剂量极为敏感。使用FSH总剂量60-132IU处理的5只母羊,冲出的卵子均未受精;使用37-44IU处理的5只母羊均冲出受精卵,共采集可用胚72枚,其中2只使用42IU处理的母羊分别冲出可用胚30枚和23枚[14]。贾敏等(2002)分别用2001IU、240IU、260IU、320IU,每种剂量处理4只母羊,结果240IU平均冲卵数为26.2枚,其它3组平均冲卵数为19-19.5枚,至于冲出的卵受精与否,作者没有介绍[9]。 
  2.3.2 不同产地FSH对MO效果的影响。余文莉等(1997)使用宁波产和中科院产的FSH处理37只绒山羊,结果宁波产的FSH超排效果优于中科院产[15]。包呼格乐图等证实,使用加拿大产FSH,供体数、采集的胚胎数大大高于中科院产FSH,并发现国产药物组发情和排卵不集中[16]。笔者利用宁波产FSH和新西兰产FSH进行超排处理,进口FSH效果优于国产FSH[5]。一般认为国产FSH质量不稳定,FSH制剂中的高含量LH未能有效去除。 
  2.3.3 不同激素对MO效果的影响。在过去的超排处理中,最多应用的为PMSG,仅注射1次,而在近年来的波尔山羊ET过程中,基本上倾向于FSH,而很少使用PMSG,一般认为PMSG的半衰期过长,使用时易引起肿大,不排卵的卵泡增多,高剂量使用时上述现象更严重。而FSH半衰期短,需连续注射3-4d,但FSH一般无卵巢囊肿和持续发情等,稳定性好。有人研究PMSG+APMSG抗体,用抗体中和剩余的PMSG,有待于在波尔山羊ET中进一步验证。为了克服FSH半衰期短,注射烦琐的弱点,近年来有人采用聚乙烯吡咯烷酮(PVP)作为FSH的载体,和FSH混合后注射,可使FSH缓慢释放,从而延长FSH的作用时间,一次性注射即可达到超排的目的。王希朝等(1999)给山羊放置阴道海绵栓,同时肌注二醇2mg,预处理7d,然后用300g/LPVP5-6ml溶解FSH250-300IU一次肌注,处理后第3d下午撤栓,同时皮下注射PGF20.6mg,取得了较好的超排效果[17]。 
  2.3.4 个体差异对MO效果的影响。波尔山羊的年龄、营养状况都会影响超排效果。一般繁殖力高的个体优于繁殖力低的个体,成年羊优于未成年羊,营养状况好的优于营养差的,山羊优于绵羊。Tervit利用孕酮+PMSG对安哥拉山羊和莎能山羊进行超排,结果莎能山羊的排卵数(24.5)明显高于安哥拉山羊。 
  2.3.5 季节对MO效果的影响。刘翠侠等(2002)在2001年4-5月对10只供体羊超排,结果3只发情,羊均冲胚5.3枚,而同年10-11月对5只供体羊超排,结果5只全部发情,羊均冲胚24.6枚[7]。贾敏等报道,繁殖季节波尔山羊卵巢良好的占70%,非繁殖季节发育多一般,良好的仅占20%[9]。苏和等(2001)6月对6只供体羊进行超排,平均冲胚15.17枚,其中可用胚10枚;10月中旬至11月中旬对30中供体羊进行超排,平均冲胚20.4枚,其中可用胚17.8枚[10]。马国辅等(2002)在繁殖季节对27只供体羊进行超排,结果有2只未发情,25只羊冲出胚胎146枚,其中可用胚为117枚[13]。 
  2.3.6 重复超排对MO效果的影响。赵霞等(2002)在2001年9月28日对20只供体羊进行超排,结果冲胚385枚,其中有效胚胎346枚。间隔65天后,于12月2日进行重复超排,结果20只供体无效3只,有效17只,冲胚315枚,其中有效胚胎295枚,头均冲胚数比第1次低0.72枚,有效胚比第1次高0.05枚[18]。张锁林等(2001)在首次试验基础上选择了9只波尔山羊进行重复超排,首次超排卵巢发育良好的为8/9,平均获卵21.9枚;重复超排后卵巢发育良好的为6/9,平均获卵17.8枚[19],证明在较短时间内进行重复超排,虽然效果稍低于首次,但可取得较满意的效果。 
  2.3.7不同年龄对MO 效果的影响。张立等(2002)选用10-15月龄的31只育成波尔山羊共冲出422枚胚胎,其中可用胚为319枚[4]。笔者对11只8-12月龄的育成羊与产过一胎以上的26只成年羊进行MO效果比较,结果育成羊羊均冲胚9.18枚,比成年羊的羊均15.38枚低6.2枚,差异显著(P<0.01=[5]。 
  2.3.8 LH对MO效果的影响。侯引绪等(2002)对14只奶山羊在发情的第15d注射FSH,连续3 d,每d2次,按130IU、120IU、100IU递减,最后一 次注射时,注射氯前列烯醇0.5ml/只,发情后配种,配种时7只注射LH50IU,7只不注射,结果LH组冲胚51枚,非LH组冲胚49枚,差异不显著(P>0.05)[19]。 
  胚胎移植——供体羊和受体羊↓ 
  3、受体羊的处理 
  ET的原则是供体和受体在种属上必须一改,在生理上必须同期化。因为母羊在发情后的最初一段时间里(周期性黄体期)不论是否受精,生殖系统均处于相同的生理状态之下,怀孕与未孕并无区别。所以,发情后母羊生殖器官的孕向变化,是进行ET的主要生理依据。在供体羊进行MO的同时。必须对受体羊进行发情同期化处理[1]、[3]。目前国内对受体母羊的同期发情处理方案报道较少。肖后军等(2002)采取的方案是:第0d注射PG,第13d注射PG,第15天注射LRH,第18天手术,结果3批羊的同期发情率分别为80%(40/50)、93.3%(56/60)、86.7(52/60),平均为87%[11]。张一玲、渊锡潘(1992)对山羊非繁殖季节诱发发情的方案是:18甲基炔诺酮耳皮下埋植9天,取管后第2d注射PMSG15IU/kg,结果同期发情率81%(94/116)[20]。张居农等(1999)采用空胎母羊→肌注复合孕酮制剂,口服MAP→埋植非繁殖季节PRID12d→埋植PRID的第11天注射PMSG→PMSG注射后第2d撤栓→撤栓第2d试情,发情配种进注射HCG,结果21只羊有17头排卵[21]。笔者采用进口海绵栓,放栓第16d注射PMSG200IU,第17天撤栓,同期发情率为94.6%(193/204)[5]。 
  4、胚胎的回收与移植 
  4.1 手术方法。 
  目前,波尔山羊胚胎回收应用最广泛的方法仍然是手术法。但由于手术本身对供、受体羊造成损伤,容易造成输卵管、子宫、卵巢等部分的粘连,对波尔山羊母羊的多次重复利用产生了不利影响。特别是手术不熟练、消毒不严等,甚至导致终生不育,影响了波尔山羊ET的进展。为此,人们一直致力于非手术法或简易手术法的研究。国内成充等(1985)和罗承浩(1989)做过子宫颈非手术采卵尝试,采卵成功率30-50%。张翊华等用盐酸丁卡因松驰山羊子宫颈进行非手术采胚(1995)[23],后又自制金属外管和树脂内管组成的采胚管非手术采集山羊胚胎,头均采到4枚[24]。采用此法,其原因山羊子宫颈管道弯曲较多,采卵管通过困难,且羊直肠细小,不能通过直肠把握操作子宫[3]。郭志勤等借鉴母猪去法,在受体羊大腿内侧鼠蹊部作切口(约2cm),将食指伸进腹腔探测黄体并勾出同侧子宫角,移入胚胎后送回子宫角复位,减小了创口,缩短了时间[22]。1987年,王光亚等用腹腔镜进行山羊供体超排效果观察及胚胎回收,提高了手术成功率[22]。近年来,人们开始将腹腔镜引入波尔山羊ET,取得了较好的效果。但在供体羊冲胚过程中,目前仍沿袭手术方法,手术部位有乳房下方腹中线,腹中线两侧、大腿内侧鼠蹊部,以腹中线两侧切口最为常见。 
  4.2 采卵方法。 
  目前采用的采卵方法基本上有3种,第1种是输卵管法,以发情日为0d,在2-3d从输卵管采卵,优点是收效高,冲卵液用量少,检卵省时间,缺点是容易造成输卵管的损伤和伞部粘连。第2种是子宫法,以发情日为0d,在5-7d从子宫采卵,优点是对输卵管损伤甚微,缺点是回收率较输卵管法低,用液多,检卵管费时。侯引绪等(2002)把对3日龄左右胚胎进行既能冲洗回收子宫内胚胎,又能冲洗回收输卵管内胚胎的方法称为子宫/输 卵管胚胎回收法,即在子宫角的前1/3处夹住并插入进液针头,回收管仍处在输卵管喇叭口处,可提高胚胎回收率,针刺孔上移至子宫角上,可综合输卵管法和子宫法二者的优点[25]。 
  5、ET妊娠效果 
  ET效果的关键指标是妊娠率。胚胎移入受体能否成活,取决于波尔山羊供体和受体的生理一致性,解剖部位的一致性、胚胎的发育阶段、胚胎的质量和受体羊全身及生殖器官的生理状态[3],再就是胚胎收集和移植的时间应在黄体期的早期以及胚胎附植之前进行,一般不超过发情配种后的第7d,最好在第3-4d[1]。 
从国内的部分报道来看,影响ET妊娠率主要有: 
  5.1 胚胎类型。 
  肖群等(2002)的试验结果为:妊娠率最高为4c,达32.1%(18/56),2c次之,为12.5%,1c的7.1%,8c的2只受体未受孕[11]。贾敏等 (2002)报道,以6-8c妊娠率最高,为67.75%(21/31),16c次之,为66.7%(2/3),第3为4c,为58.9%(201/346),第4为2-3c,为48.8%(43/88)[9]。杨亚卫等(2002)报道,配种后第6-7d从子宫角采得胚胎中,囊胚妊娠率最高,为66.2%(43/65),早期囊胚次之,为59.4%(19/32),第3为扩张胚,为57.7%(45/78),第4为桑棋胚,为52.6%(81/154),孵化胚最差,为52.2%(24/46),并认为在非繁殖节季,配种后第7d胚胎多为扩张囊胚和孵化胚,第6.5天多为早期囊胚和囊胚,第6d多为桑椹胚;而在繁殖季节,第7d多为囊胚,第6.5d多为早期囊胚,第7.5-8d多为扩张胚和孵化胚,因此建议非繁殖季节以第6.5天采胚为佳,繁殖季节以第6.5-7天采胚为佳[8]。 
  5.2 胚胎数量。 
  杨亚卫等(2002)试验结果,单胚移植的妊娠率为54.1%(53/98),双胚为51.7%(77/49),3胚为66.7%,差异不显著(P>0.05)[8]。闫振富等(2001)移入单胚的妊娠率为100%(2/2),移入双胚的受体羊26只,产仔40只,产仔数占移入胚胎数的76.9%,移入3胚的6只,产仔11只,产仔数占移入胚胎数的61.1%,说明以移入双胚效果最佳[26]。赵国财等(2001)用当地白山羊245只作为受体,移入胚胎406枚,妊娠率为55%。 
  6、发展前景 
  ET技术在波尔山羊的繁殖应用上已较为成熟,在生产上得到了较大面积推广应用,加快了波尔山羊的繁殖速度,促进了我国肉羊产业的发展。但是,ET技术是一种生物技术,是一项复杂的、细致的、完整的系统工作,由许多环节所构成,有严格的系统性,要求所有步骤和细节都必须准确无误,任何环节出了问题,都会造成前功尽弃。虽然近年来对波尔山羊ET成功的报道较多,但其中的隐情让人不得而知。根据笔者调查,超排效果的不稳定性,供体羊术后的生殖器官损伤,大大制约了波尔山羊ET的发展,因此,还必须在诸多方面进行深入细致的研究,使ET技术得到不断地完善,在我国肉羊改良和生产方面发挥更大的作用。 
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二○○三年四月 

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